Флуарэсцэнтны фільтр з'яўляецца важным кампанентам флуарэсцэнтнага мікраскопа.Звычайная сістэма мае тры асноўныя фільтры: фільтр узбуджэння, фільтр выпраменьвання і дыхроічнае люстэрка.Звычайна яны спакаваныя ў куб, так што група ўстаўляецца разам у мікраскоп.
Як працуе флуарэсцэнтны фільтр?
Фільтр ўзбуджэння
Фільтры ўзбуджэння прапускаюць святло пэўнай даўжыні хвалі і блакуюць хвалі іншых даўжынь.Іх можна выкарыстоўваць для атрымання розных колераў, наладзіўшы фільтр, каб прапускаць толькі адзін колер.Фільтры ўзбуджэння бываюць двух асноўных тыпаў — доўгапрапускаючыя і паласавыя.Узбуджальнікам звычайна з'яўляецца паласавы фільтр, які прапускае толькі даўжыні хваль, паглынутыя флюарафорам, мінімізуючы такім чынам узбуджэнне іншых крыніц флуарэсцэнцыі і блакуючы святло ўзбуджэння ў паласе выпраменьвання флуарэсцэнцыі.Як паказана сіняй лініяй на малюнку, BP складае 460-495, што азначае, што ён можа праходзіць толькі праз флуарэсцэнцыю 460-495 нм.
Ён размяшчаецца ў межах траекторыі асвятлення флуарэсцэнтнага мікраскопа і адфільтроўвае ўсе даўжыні хваль крыніцы святла, за выключэннем дыяпазону ўзбуджэння флюарафора.Мінімальная прапускальнасць фільтра вызначае яркасць і яркасць малюнкаў.Рэкамендуецца мінімум 40% перадачы для любога фільтра ўзбуджэння, каб у ідэале прапусканне было >85%.Прапускная здольнасць фільтра ўзбуджэння павінна быць цалкам у межах дыяпазону ўзбуджэння флюарафора, каб цэнтральная даўжыня хвалі (CWL) фільтра была як мага бліжэй да пікавай даўжыні хвалі ўзбуджэння флюарафора.Аптычная шчыльнасць (OD) фільтра ўзбуджэння вызначае цемру фонавага малюнка;OD - гэта паказчык таго, наколькі добра фільтр блакуе даўжыні хваль за межамі дыяпазону перадачы або паласы прапускання.Мінімальны OD 3,0 рэкамендуецца, але OD 6,0 або больш з'яўляецца ідэальным.
Выкідны фільтр
Эмісійныя фільтры служаць для таго, каб жаданая флуарэсцэнцыя ўзору даходзіла да дэтэктара.Яны блакуюць больш кароткія хвалі і маюць высокую прапускальнасць для больш доўгіх хваль.Тып фільтра таксама звязаны з лічбай, напрыклад, BA510IF на малюнку (інтэрферэнцыяльны бар'ерны фільтр), гэта абазначэнне адносіцца да даўжыні хвалі на 50% ад максімальнага прапускання.
Тыя ж рэкамендацыі для фільтраў узбуджэння дзейнічаюць для фільтраў выпраменьвання: мінімальная прапусканне, прапускная здольнасць, OD і CWL.Эмісійны фільтр з ідэальнай камбінацыяй CWL, мінімальнай перадачы і OD забяспечвае максімальна яркія выявы з максімальна глыбокім блакаваннем і забяспечвае выяўленне самых слабых сігналаў выпраменьвання.
Дихроическое люстэрка
Дыхроічнае люстэрка размешчана паміж фільтрам узбуджэння і эмісійным фільтрам пад вуглом 45° і адлюстроўвае сігнал узбуджэння ў бок флюарафора, адначасова перадаючы сігнал выпраменьвання ў бок дэтэктара.Ідэальныя дыхроічныя фільтры і раздзяляльнікі прамяня маюць рэзкія пераходы паміж максімальным адлюстраваннем і максімальным прапусканнем з >95% адлюстраваннем для паласы прапускання фільтра ўзбуджэння і прапусканнем >90% для паласы прапускання выпраменьвальнага фільтра.Выбірайце фільтр з улікам даўжыні хвалі перасячэння (λ) флюарафора, каб мінімізаваць рассеянае святло і максімальна павялічыць суадносіны сігнал/шум флуарэсцэнтнай выявы.
Дыхроічнае люстэрка на гэтым малюнку - гэта DM505, названае так таму, што 505 нанаметраў - гэта даўжыня хвалі пры 50% максімальнага прапускання для гэтага люстэрка.Крывая прапускання для гэтага люстэрка паказвае высокае прапусканне вышэй за 505 нм, рэзкае падзенне прапускання злева ад 505 нанаметраў і максімальную адбівальную здольнасць злева ад 505 нанаметраў, але ўсё яшчэ можа мець некаторы прапусканне ніжэй за 505 нм.
У чым розніца паміж доўгапрапускаючымі і паласавымі фільтрамі?
Флуарэсцэнтныя фільтры можна падзяліць на два тыпу: доўгапрапускаючыя (LP) і паласавыя (BP).
Фільтры доўгага праходжання прапускаюць доўгія хвалі і блакуюць больш кароткія.Даўжыня хвалі адключэння - гэта значэнне пры 50% пікавай прапускання, і ўсе даўжыні хваль, якія перавышаюць даўжыню хвалі адключэння, прапускаюцца фільтрамі доўгага праходжання.Яны часта выкарыстоўваюцца ў дыхроічных люстэрках і эмісійных фільтрах.Фільтры доўгага праходжання варта выкарыстоўваць, калі прымяненне патрабуе максімальнага збору выпраменьвання і калі спектральная дыскрымінацыя непажаданая або неабходная, што звычайна мае месца для зондаў, якія генеруюць адзіны выпраменьваючы від узораў з адносна нізкім узроўнем фонавай аўтафлуарэсцэнцыі.
Паласавыя фільтры прапускаюць толькі пэўны дыяпазон даўжынь хваль і блакуюць іншыя.Яны памяншаюць перакрыжаваныя перашкоды, дазваляючы прапускаць толькі самую моцную частку спектру выпраменьвання флюарафора, памяншаюць шум аўтафлуарэсцэнцыі і, такім чынам, паляпшаюць стаўленне сігнал/шум у узорах аўтафлуарэсцэнцыі з высокім фонам, чаго не могуць прапанаваць фільтры доўгага праходжання.
Колькі тыпаў флуарэсцэнтных фільтраў можа паставіць BestScope?
Некаторыя распаўсюджаныя тыпы фільтраў ўключаюць сіні, зялёны і ультрафіялетавы фільтры.Як паказана ў табл.
| Набор фільтраў | Фільтр ўзбуджэння | Дихроическое люстэрка | Бар'ерны фільтр | Святлодыёдная лямпа Даўжыня хвалі | Ужыванне |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 нм | ·FITC: метад флуоресцентных антыцелаў ·Ацыдынавы апельсін: ДНК, РНК ·Аўрамін: сухотная палачка ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 нм | ·Радамін, TRITC: метад флуоресцентных антыцелаў ·Прапідый ёдыд: ДНК · RFP |
| U | ВР330-385 | DM410 | BA420 | 365 нм | ·Аўтафлуарэсцэнтнае назіранне ·DAPI: афарбоўка ДНК ·Hoechest 332528, 33342: выкарыстоўваецца для афарбоўвання храмасом |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 нм | · Катехоламінов ·5-гидрокситриптамин · Тэтрацыклін: Шкілет, Зубы |
| R | BP620-650 | DM660 | ВА670-750 | 640 нм | · Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Наборы фільтраў, якія выкарыстоўваюцца пры атрыманні флуарэсцэнцыі, распрацаваны з улікам асноўных даўжынь хваль, якія выкарыстоўваюцца ў прылажэннях флуарэсцэнцыі, што заснавана на найбольш часта выкарыстоўваюцца флуарафорах.Па гэтай прычыне яны таксама названы ў гонар флюарафора, які яны прызначаны для візуалізацыі, напрыклад кубы фільтра DAPI (сіні), FITC (зялёны) або TRITC (чырвоны).
| Набор фільтраў | Фільтр ўзбуджэння | Дихроическое люстэрка | Бар'ерны фільтр | Святлодыёдная лямпа Даўжыня хвалі |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 нм |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 нм |
| TRITC | ВР528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 нм |
| FL-аўрамін | BP470 | DM480 | BA485 | 450 нм |
| Тэхаскі чырвоны | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 нм |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 нм |
Як выбраць флуарэсцэнтны фільтр?
1. Прынцып выбару флуарэсцэнтнага фільтра заключаецца ў тым, каб святло флуарэсцэнцыі/выпраменьвання праходзіла праз канец візуалізацыі як мага далей і адначасова цалкам блакавала ўзбуджальнае святло, каб атрымаць найвышэйшае стаўленне сігнал/шум.Асабліва для прымянення шматфатоннага ўзбуджэння і мікраскопа з поўным унутраным адлюстраваннем слабы шум таксама будзе выклікаць вялікія перашкоды для эфекту візуалізацыі, таму патрабаванні да суадносін сігнал/шум вышэй.
2. Ведаць спектр узбуджэння і выпраменьвання флюарафора.Каб пабудаваць набор флуарэсцэнтных фільтраў, які стварае высакаякасны, высокакантрастны відарыс з чорным фонам, фільтры ўзбуджэння і выпраменьвання павінны дасягаць высокай прапускальнасці з мінімальнай пульсацыяй паласы прапускання ў рэгіёнах, якія адпавядаюць пікам узбуджэння або выпраменьвання флюарафора.
3. Улічвайце даўгавечнасць флуарэсцэнтных фільтраў.Гэтыя фільтры павінны быць непранікальнымі для інтэнсіўных крыніц святла, якія ствараюць ультрафіялетавае (УФ) святло, якое можа прывесці да «выгарання», асабліва фільтра ўзбуджальніка, паколькі ён падвяргаецца ўздзеянню поўнай інтэнсіўнасці крыніцы асвятлення.
Узоры розных флуарэсцэнтных малюнкаў
Рэсурсы збіраюцца і арганізуюцца ў Інтэрнэце і выкарыстоўваюцца толькі для навучання і зносін.Калі ёсць якія-небудзь парушэнні, калі ласка, звяжыцеся з намі, каб выдаліць.
Час публікацыі: 9 снежня 2022 г